ターゲットリシーケンスにより体細胞モザイクのハイスループット検出が可能
Saumya Jamuar博士は、脳奇形における希少なモザイク変異を同定するために、最初の系統的ハイスループットアプローチでターゲットリシーケンスを使用しています。
ターゲットリシーケンスにより体細胞モザイクのハイスループット検出が可能
はじめに
異なる遺伝子型を持つ2つ以上の細胞集団につながる体細胞変異は、がんで特徴付けられています。しかし、遺伝性疾患における体細胞変異の役割は認識されていますが、神経発達疾患におけるその有病率は最近になって系統的に評価されました。
従来、遺伝的バリアントの同定は、キャピラリー電気泳動（CE）/サンガーシーケンスで行われてきました。しかし、この反復的なプロセスには時間がかかり、労力がかかり、希少バリアントの同定を妨げる検出限界があります。1次世代シーケンサー（NGS）などの新しいテクノロジーにより、サイエンティストは研究の範囲を広げ、発見までの道のりを短縮することができます。
シンガポールのKK Women’s and Children’s Hospitalの臨床遺伝学者であるSaumya Jamuar医学博士と、革新的なゲノミクス研究開発企業であるGlobal Gene Corpの共同創業者であるSaumya Jamuar博士は、脳皮質の奇形に関連する体細胞変異を特定するための最初の系統的でハイスループットなアプローチを開発しました。2 彼は、MiSeqシステムとTruSeq Custom Ampliconアッセイを用いたNGSを使用してこの研究を実施しました。
iCommunityはJamumar博士と、ターゲットリシーケンスパネルの開発と、ヒトの健康を改善するためにNGSをどのように使用しているかについて話しました。
Q：なぜ医師になったのですか？
Saumya Jamuar（SJ）：医学は、他の人の生活を非常に直接的な方法で、最も脆弱な時点で変えることができる職業です。小児科医として、私は常に子供たちを助けるのは難しいと感じていますが、特に子供たちが良くなったときに、相談の最後に感謝の言葉を聞くのはとても満足です。その喜びと仕事への満足度が、私の練習の原動力となっています。
Q：医学の実践に加えて、科学研究を追求したきっかけは何ですか？
SJ：シンガポールの小児科研修所を学び、修了した後、ハーバード大学医学部で政府支援の遺伝学フェローシップを修了しました。フェローシップを修了した後、私はハーバードに留まり、クリストファー・ウォルシュ博士の研究室で博士課程を修了しました。そこで、私は臨床医から臨床医サイエンティストへと移行しました。クリニックにいるとき、一度に一人の患者しか手助けできないことに気づきました。しかし、ラボでは、人の健康に影響を与える可能性のある研究を実施することで、より多くの患者を支援することができます。
トランスレーショナルリサーチに大きなギャップがあることに気づきました。トランスレーショナルリサーチは、基礎科学研究や臨床試験と同じペースでは行われておらず、患者ケアへの基礎科学研究の応用が不足していました。臨床医学における私の経歴とWalshラボの基本研究能力は、トランスレーショナル医療を実践する絶好の機会を与えてくれました。その時、イルミナにも精通しました。
クリニックにいるとき、一度に一人の患者しか手助けできないことに気づきました...私は、人の健康に影響を与える可能性のある研究を実施することで、より多くの患者を支援することができます。
Q：Walshラボでどのような研究を行いましたか？
SJ：私は常に神経疾患、特に脳の発達、そしてその過程におけるエラーが脳の奇形にどのようにつながるかに関心を持ってきました。Walsh教授は神経学者であり、脳奇形と神経精神疾患の遺伝学の分野でリーダーであるため、Walshラボは私にとって最適な場所でした。私のプロジェクトは、脳奇形の体細胞変異を調べるための体系的なアプローチの開発を目指していました。
Q：イルミナのシステムと製品はWalshラボで使用されていましたか？
SJ：ラボはイルミナのシステムに投資していませんでした。代わりに、コアラボまたはサービスラボでシーケンスを実施しました。彼らは、イルミナのテクノロジーを使用した別のプロバイダーにシーケンスサンプルを送ります。プロジェクトの背景研究の一環として、イルミナTruSeq Custom Amplicon、Agilent HaloPlex、Ion Torrentアンプリコンシーケンスなど、2012年に利用可能なさまざまな製品に関する情報を読みました。私が検討したのはこれら3つで、多くの検討を経て、私はTruSeq Custom Ampliconに協力することに決めました。
Q：TruSeq Custom Ampliconを選んだ理由は何ですか？
SJ：その理由の1つは、実験のデザインとパネルのカスタマイズが比較的簡単だったためです。DesignStudio Softwareを使用してTruSeq Custom Ampliconをテストしたところ、プロセスはかなり簡単でした。遺伝子名を入力し、エクソンとイントロンの境界でどれだけの隣接が必要かを指定しました。その2日後、私は自分の要件のほとんどを満たす設計をしました。パネルを最適化するにはいくつかの追加ステップが必要でしたが、これは簡単なプロセスでした。
2つ目の理由はイルミナのテクノロジーの評判でした。さまざまなテクノロジーに精通している人々と話をする際、データ品質が頑健であったため、イルミナのテクノロジーを使用するようにアドバイスされました。結局、それは私たちにとって良い結果となりました。
イルミナのテクノロジーは、データ品質が非常に堅牢だったため、利用するようアドバイスを受けました。結局、それは私たちにとって良い結果となりました。
Q：NGSの前の数日間、あなたはサンガーシーケンスを使用してこの試験を実施していたでしょう。当時、バリアント検出における変異を同定するためのサンガーシーケンスの長所は何でしたか？
SJ：実際、バリアント検出にサンガーシーケンスを使用する利点はあまりありませんでした。サンガーシーケンスは遺伝子ごとに進行するため、長いプロセスでした。時には、ラボは多くの遺伝子をシーケンスし、結果が得られないことがあります。NGSでは、関心のあるすべての遺伝子を1つのパネルにまとめ、1つの反応を行い、結果を待ちました。
また、サンガーシーケンスではモザイクバリアントの検出限界が約15～20%です。モザイク現象を検出しようとすると、これらのバリアントの割合は5%と低く、サンガーシーケンスではこれらのバリアントを検出できないことがわかりました。2 TruSeq Custom Ampliconを使用すると、キャリブレーションサンプルに基づいて1%の検出限界までモザイク現象を簡単に検出できます。2サンガーシーケンスと比較して、比較的簡単なプロセスでした。研究者は、10年以上にわたりモザイクを系統的に検出しようとしてきました。TruSeq Custom AmpliconパネルとMiSeq Reporter Softwareにより、1週間以内にこれらのモザイクバリアントを特定できました。NGSはモザイクバリアント検出を非常に効率的なプロセスに変えました。
しかし、これらのモザイクバリアントの検証には時間がかかりました。バリアントが本物であり、シーケンスエラーによるものではないことを証明する必要がありました。サブクローニングされた個々のコロニーのサンガーシーケンスを使用してそれを証明し、達成までにさらに6か月かかりました。低頻度バリアントの検証は依然として問題であり、異なるラボでは、30%未満のバリアントの検証の代替方法を検討しています。
Q：体細胞モザイク現象や脳奇形を特に調べたのはなぜですか？
SJ： Walshの研究室では、ダブルコルチンをコードするDCX遺伝子にモザイク現象があり、文字通り“平滑脳”奇形である二重皮質（DC）症候群とX連鎖性リッセンセファリー（XLIS）が引き起こされるというエビデンスが発見されました。3 リッセンセファリーの小児は、通常、神経学的に破壊的であり、てんかん、発達遅延、摂食の問題、誤嚥性肺炎に苦しむ可能性があります。
脳の奇形は、MRIなどの構造的画像で容易に同定できます。脳後頭葉脳の脳溝（毛穴）と脳回溝（隆起）の欠損を視覚化できます。しかし、DCはスペクトラム障害であり、てんかん患者もいますが、かなりうまく機能しています。発達が遅れることはありません。MRIでは、リッセンセファリーに似たいくつかの変化が見られますが、完全には見られません。これは、ニューロンの細胞自律的な性質によるものです。変異のないニューロンは、予想通りに成長し、遊走し、正常な皮質を形成します。DCX変異を持つニューロンは移動障害を示し、正常な皮質の下にあるニューロンの異所性帯が形成されるため、二重皮質という名前になります。脳のモザイク現象は放射線学的所見から明らかでしたが、疑問は残りました。どの程度重要でしたか？ イメージングで脳奇形のエビデンスがあるこれらの家族のうち、実際にサンガーシーケンスが見逃したモザイク現象があったのは何家系ですか？
TruSeq Custom Ampliconを使用すると、モザイクを理論上の検出限界である1%まで簡単に検出できます。NGSはモザイクバリアントの検出を非常に効率的なプロセスに変えました。
Q：TruSeq Custom Ampliconを使用することにより、サンガーシーケンスでは意味をなさかった結果のいくつかをどのように明らかにできましたか？
SJ：一部のモザイクバリアントは、検出レベル未満であったため、サンガーでは見落とされました。患者の1人が全エクソームシーケンスを受けており、シーケンスカバレッジが非常に低いため、バリアントが見逃されました。TruSeq Custom Ampliconは、脳の奇形に関連する遺伝子をターゲットに、ゲノムの特定の領域を200～500́以上ディープシーケンスすることを可能にしました
Q：他の神経発達障害を調べるためにターゲットアプリケーションが使用されましたか？
SJ：Walshの研究室などは、ターゲットシーケンスを使用して、自閉症などの他の神経発達障害における体細胞変異を検出しています。4
Q：他のラボではNGSを使用して、異なる神経疾患における体細胞変異を検出していますか？
SJ：最近、重度の知的障害を引き起こすバリアントを検出するために全ゲノムシーケンスを使用した研究があります。5NGSを用いたてんかんの体細胞変異を示す論文もあります。
Q：そこで、あなたの研究は、体細胞変異がこれらの疾患で果たしている役割を研究するための新たな扉を開きましたか？
SJ：体細胞変異の検出において、NGSはサンガーシーケンスのより良い代替品であることを明確に示しました。8人の体細胞変異が発見され、そのうちの3分の2が従来のサンガーシーケンスでは見逃されていました。そのうちの1人は、答えを求めて全エクソームシーケンスに進みました。しかし、実際には、モザイク変異を見つけるためにディープシーケンスを実施しなければなりませんでした。
体細胞変異の検出にNGSを使用したのは初めてではなかったことを強調する必要があります。研究者が全エクソームシーケンスを行い、体細胞変異を発見した個別の症例報告がありました。しかし、体細胞変異を同定するための初の系統的なハイスループットアプローチを開発しました。そして現在、一部の臨床検査室では、体細胞変異を探すためにディープターゲットシーケンスの使用を開始しています。
“MiSeq Reporterは、データが不十分であったためではなく、そうでなければ検出されずに済んだであろう変異を検出することができたが、アライメントに適切なツールを使用していなかった。”
Q：MiSeqシステムを選んだ理由は何ですか？
SJ：MiSeqシステムおよびHiSeqシステムに送られ、HiSeq 2000システムのターンアラウンドタイムは14日でした。デザインに問題があったかどうかすぐに知りたいので、スループットが40時間以内に結果をもたらしたため、MiSeqシステムを選びました。ライブラリーをシステムにロードし、翌日に結果が出ました。
HiSeq 4000システムのターンアラウンドタイムが1～3日以内になったことを考えると、これははるかに高いスループットを提供するオプションです。これにより、研究者はより多くのサンプルを測定することができます。
Q：MiSeq Reporterソフトウェアはあなたの研究にどのように役立ちましたか？
SJ：私がNGSと仕事を始めたとき、イルミナが優れたシーケンスケミストリーを製造し、優れたパネルを作ることはわかっていましたが、バイオインフォマティクスの能力については悲観的でした。MiSeq Reporterを使用した後、それは変わりました。異なるアルゴリズムやパイプラインを使用して独自のバイオインフォマティクスを実行しようとしたのですが、必要な答えが得られませんでした。MiSeq Reporterを試してみると、それは簡単なプロセスであり、最終的には成功しました。
DNAから報告までのソリューションが間違いなく役立ちます。シーケンスパネルを使用する場合は、シーケンサーで実行しますが、これは最初のステップにすぎません。バイオインフォマティクスは重要ですが、困難な場合もあります。MiSeq Reporterを使用するコツは、ターゲット領域に局所的なアライメントを行ったことです。FASTQファイルを自分でアラインしようとしましたが、全ゲノムにアラインしていました。フィラミンAタンパク質をコードするFLNAなどの大きな遺伝子では、リードの多くが誤ってマッピングされ、廃棄されていたため、50%のアライメントしか得られませんでした。MiSeq Reporterソフトウェアを使用して同じデータを実行したところ、アライメントは50%から90%に増加しました。MiSeq Reporterは、データが不十分であったためではなく、そうでなければ検出されなかったはずの変異を検出することができたが、アライメントに適切なツールを使用していなかった。
NGSは、私が医療を実践する方法を変えました。遺伝性疾患のために子供に一連の問題があることを両親に説明し、変異を同定してより正確な答えを与えるのに役立ちます。
Q：KK Women’s and Children’s Hospital（KKH）のシンガポールに戻った今、現在の研究にイルミナNGSシステムを使用していますか？
SJ： シンガポールに戻った後、私はKKHで未診断の疾患プログラムの臨床リーダーになりました。これらの被験者に対して全エクソームシーケンスを実施するためにHiSeq 4000システムを使用しています。症候群の個人については、MiSeqシステムTruSightInherited Disease Sequencing Panelを、既知の遺伝子の変異を同定するための最初のパスとして使用しています。陰性の場合は、全エクソームシーケンスまたは全ゲノムシーケンスのいずれかに進みます。後者はHiSeq X Tenシステムで行います。
Q：これらのイルミナのシステムは、KKHに到着する前にKKHにありましたか、それとも買収に影響を与えましたか？
SJ：当社はHiSeqシステムを所有していませんが、共同研究者が所有するシステムを使用しています。しかし、これまでの肯定的な経験から、MiSeqシステムを購入するよう研究所に勧めました。
Q：Global Gene Corpとは？
SJ：ボストンにいる間、私はハーバード大学の同僚の1人であるJonathan Picker教授とGlobal Gene Corpを共同設立しました。私たちの目標は、ゲノミクスを使用して世界の未開拓者集団を理解し、インド、中国、中東などのアジア市場で手頃な価格で効果的なゲノムソリューションを提供し、従来の医療を破壊し、これらの経済におけるプレシジョンメディシンの提供を可能にすることです。
Q：Global Gene Corpではどのような問題を解決していますか？
SJ：プレシジョンメディシンとゲノミクスの進歩から恩恵を受けるには、ゲノミクスデータと臨床背景を結び付け、最終患者の利益になるアプリケーションを構築する必要があります。米国やヨーロッパにはプレシジョンメディシンの専門家が多数いますが、南アジア、東南アジア、中東は世界の他の地域よりも遅れています。その結果、科学文献のデータの60%以上は、世界の人口の1%未満から得られています。例えば、インドの人口は13億人で、公開されている全ゲノムシーケンスは100未満です。1,000 Genomes Project（1KGP）にはインドの一部の代表がありますが、グジャラーティ、パンジャビ、シクスなどのインドの特定の亜集団から来ており、これらは4つまたは5つの異なるサブグループにすぎません。インド人はヨーロッパ人や白人と異なることが実証されていますが、インド国内では、インドの異なる地域の個人が主成分分析に基づいて分離される傾向があります。
Global Gene Corpは、共同研究者とともに、アジアにおけるプレシジョンメディシンの基盤を築き、インドから始め、カスタマイズされたアプリケーションを通じてゲノミクスをこれらの市場で実現しています。
実際には、バリアント検出にサンガーシーケンスを使用する利点はあまりありませんでした。長いプロセスでした...NGSでは、目的のすべての遺伝子を1つのパネルにまとめ、1つの反応を行い、結果が出るのを待ちました。
Q：これは先駆的な取り組みです。どのようにこれを達成していますか？
SJ：Global Gene Corpは、ゲノミクスを使用して、すべての人の生活にポジティブな影響を与えることに重点を置いています。つまり、疾患の情緒的コストと経済的コストの両方を解決する、特定の集団に適したカスタマイズされたアプリケーションを作成するということです。
例えば、インドでは毎年約100万人のがん患者が新たにがんにかかり、2015年には70万人が死亡すると推定されています。乳がんや卵巣がんなどの特定の種類のがんでは、毎年15万人の新規症例が検出されています。インドの5年間の生存可能性は52%であり、米国では89%であり、クラスとしての腫瘍学薬剤の有効性が低いことが研究で示されています。インドでは、英国のパートナーと共同で個別化化学療法を開始しています。これは、表現型と遺伝子型および薬物相互作用の情報を組み合わせて、すべての個人にとって最も効果的な治療計画を特定するものです。また、ゲノミクスに関する知見や集団のコホートに対する専門知識とアクセスにより、製薬会社がターゲット集団に適した、より優れた革新的でパーソナライズされた医薬品を開発できるよう支援しています。
Q：購買力はなぜ重要な重点分野なのでしょうか？
SJ：私はインドに生まれ、製品を手頃な価格で配送する際の課題と機会についてよく知っています。Global Gene Corpの重点市場には、価格帯を買うことができる患者がかなりいますが、手頃な価格のピラミッドは、当然ながら、治療の手頃な価格が高いほど、このエキサイティングなテクノロジーから恩恵を受けることができる人の数が増えることを意味します。そのため、私たちの精神の核心となる重要な質問の1つは、配送チェーンを手頃な価格にするためにどのように取り組むことができるかということです。最終的には、科学の応用を革新してパーソナライズされた製品を作り、コスト構造の効率を高めて、できるだけ多くの人々に利益をもたらすことが目標です。
“私たちの目標は、ゲノミクスを使用して世界の未開拓者集団を理解し、アジア市場で手頃な価格で効果的なゲノムソリューションを提供することです...”
Q：医師としての在職中、NGSは医薬品にとってどのような意味がありましたか？
SJ：NGSは、私が医療を実践する方法を変えました。遺伝性疾患のために子供に一連の問題があることを両親に説明し、変異を同定してより正確な答えを与えるのに役立ちます。さらに重要なのは、将来の再発リスクについて心配する必要があるかどうかがわかることです。心配の原因があっても、変異がわかっているので、妊娠中にそれらを導く方法があります。NGSの前には、これを行うことはできませんでした。生殖機能停止という用語は、家族が障害のある子供を産んだ後に子供をもう産まないというものです。分子病因が診断されていない遺伝性疾患であれば増加します。分子診断を知ることですべてが変わるのです。今では、両親に私たちが助けてくれると言えるからです。
Q： NGSの将来についてどう思いますか？ NGSは将来、医学にどのような影響を与えるか？
SJ：振り返ってみると、今世紀の最大の成果は、内向きに人間を見つめ、私たちの働き方を理解することに関連するものだと思います。ゲノミクスは、私たちの生涯における破壊的な“テクノロジー”であり、内向きに見てパズルのピースをまとめるというこの特権を私たちにもたらすものだと思います。
以前は、臨床遺伝学は潜在的な症候群の同定と合併症の予測的な管理に関するものでした。NGSでは、原因となる変異をより深く特定し、将来、人々がより健康的な生活を送れるように修正することができます。
CRISPRやその他の関連するゲノム編集テクノロジーなどのツールの価値と有用性が高まっていることが予想されます。サラセミアは東南アジアで一般的な遺伝性疾患であり、集団の3%がグロビン遺伝子の変異のキャリアです。今後は、あまり遠くない将来にゲノム編集ツールを使ってゲノムを編集し、実際にこのような単一遺伝子疾患を治癒すると思います。明らかに、これは将来であり、CRISPRの使用はまだ開発中です。研究者がCRISPRやその他のゲノム編集テクノロジーを最適化できれば、医学を変える可能性があります。これがNGSが臨床遺伝学の実践を根本的に変える方法であり、私を興奮させるものです。
研究者たちは、10年以上にわたってモザイクを系統的に検出しようとしてきました。TruSeq Custom AmpliconパネルとMiSeq Reporter Softwareにより、1週間以内にこれらのモザイクバリアントを特定できました。
Q：あなたの仕事の次のステップは何ですか？
SJ：Global Gene Corpでは、これらのゲノムコホートを構築し、潜在的な新規パスウェイ、薬剤開発のための新規ターゲット、および治療法を特定する方法を見出す計画です。長期的には、今あるものではなく、個人レベルで薬をパーソナライズするよう取り組んでいます。これは、すべての人のための一つのソリューションです。各個人に合わせたソリューションのカスタマイズができれば幸いです。
Q：一人の人ではなく多くの人を助けることは、どのように感じますか？
SJ：以前は、臨床医として患者を支援していたときに、科学者として何ができるか疑問に思っていました。しかし、科学は、はるかに大規模で、場合によってはグローバルな規模で個人を支援することができます。その一部は、この種の研究を簡単に行えるNGSシステムを作るためにイルミナに与えられています。科学は、結果を得ると常により楽しくなり、患者にプラスの変化をもたらすとより満足感を得られます。
この記事で言及されている製品とアプリケーションの詳細については、
AmpliSeq for Illumina Custom DNA Panelは、製造中止となったTruSeq Custom Amplicon Panelに代わる推奨製品です。
参考文献
- Gajecka M. Unvealed mosaicism in the next-generation sequencing era . Mol Genet Genomics。2016;29(2):513-530。
- Jamuar S, Lam AN, Kircher M, et al. 脳皮質奇形における体細胞変異 N Engl J Med. 2014;371(21):2038。
- Gleeson JG, Minnerath S, Kuzniecky RI, et al. ダブルコルチン遺伝子の体細胞変異および生殖細胞系列モザイク変異は、可変表現型と関連しています。Am J Hum Genet. 2000;67:574–581。
- D’Gama AM, Pochareddy S, Li M, et al. 自閉症スペクトラム障害脳からのターゲットDNAシーケンスは、複数の遺伝子メカニズムを示唆しています。ニューロン。2015;88(5):910–917。
- Gilissen C, Hehir-Kwa JY, Thung DT, et al. ゲノムシーケンスは重度の知的障害の主な原因を同定します。自然 。2014;511(7509):344–347。