ターゲットマルチ遺伝子シーケンスパネルにより、迅速で費用対効果の高いバリアント発見を実現

はじめに

Franco Taroni医学博士は、ミラノのCarlo Besta Neurological Institute（INCB）で神経変性疾患と代謝疾患の遺伝学のユニットを率いており、彼のチームは代謝疾患と神経疾患を研究しています。25年間、彼らは研究研究にサンガーシーケンスを使用して、小脳性運動失調、痙性対麻痺、遺伝性神経障害などの希少な神経変性疾患の分子基盤を定義してきました。3年前、彼のチームはMiSeqシステム上でSangerからターゲット次世代シーケンサー（NGS）に切り替え、これらの神経変性疾患に関連する潜在的な遺伝的バリアントを同定するために異なるターゲットマルチ遺伝子パネルを使用したユニークなワークフローを開発しました。

NGSにより、Taroni博士のグループは、サンガーシーケンスよりもわずかな時間で、大幅に低コストでバリアントを同定することができます。2016年、チームは末梢神経に影響を及ぼす遺伝性神経疾患であるシャルコー・マリー・トゥース病を引き起こす新規変異を発見しました。^1-3また、巨遺伝子SYNE1の変異を同定するために、小脳性運動失調症を持つ多くの被験者をスクリーニングすることができました。⁴ Taroni博士のチームは、白質ジストロフィーや末梢神経障害に関連する新規変異の発見に焦点を当てたレビュー論文を数本持っています。

iCommunityは、Taroni博士の研究におけるターゲットマルチ遺伝子シーケンスパネルの使用、MiSeqシステムがどのように研究活動を拡大し加速しているかについて、Taroni博士と話しました。

Franco Taroni医学博士は、イタリアのミラノにあるCarlo Besta Neurological Institute（INCB）で、神経変性疾患および代謝疾患の遺伝学部門の責任者を務めています。

Q：神経疾患や代謝疾患について最初に興味を持ったことは何ですか？

フランコ・タローニ（FT）：医学部の神経学者としてトレーニングを受けました。1980年代初頭に研究室で働き始めたとき、私は神経疾患と代謝疾患の生化学的側面と代謝的側面に焦点を合わせました。これらの疾患が持つ困難な問題を解決することは、エキサイティングな課題です。

Q：Carlo Besta Neurological Instituteの使命は何ですか？

FT：同研究所の研究は、小児と成人の神経疾患と代謝疾患に焦点を当てています。希少な遺伝性疾患の例が、シーケンスを使用して新規バリアントを同定するために解読しようとしています。

Q：あなたのチームの研究の焦点は何ですか？

FT：私たちのチームは、小脳の障害、および運動障害につながる求心性および遠心性経路である脊髄小脳失調症に長年の関心と専門知識を持っています。これらの疾患はパーキンソン病とは異なります。振戦に加えて、運動の協調性も欠如しているためです。

また、皮質脊髄運動パスウェイの障害である痙性対麻痺や、中枢神経系のミエリン形成に影響を与える末梢神経やミエリンの障害にも焦点を合わせています。神経系障害は、不均一な遺伝的病因を特徴とし、多くの場合、各疾患の原因は50を超える遺伝子です。例えば、小脳機能障害を呈し、遺伝性疾患を疑う被験者については、この疾患の原因には80を超える異なる遺伝的原因がある可能性があります。

Q：ラボではサンガーシーケンスをどのくらいの期間使用しましたか？

FT：1989年にサンガーシーケンスの使用を開始し、3年前にMiSeqシステムを買収した際にNGSの使用に移行しました。

Q：サンガーシーケンスからNGSに移行するきっかけとなったのは何ですか？

FT：神経疾患や代謝疾患の不均一性により、研究におけるNGSの使用を検討することになりました。最大90～100個の遺伝子が、研究対象の疾患の表現型に寄与する可能性があります。サンガーシーケンスでは、一度に7～12個の遺伝子しか検査できません。サンガーシーケンスを使用して80の遺伝子を解析するのは手頃な価格ではありません。

NGSアプローチにより、多くの遺伝子を同時かつ費用対効果の高い方法で解析することができ、これらの疾患の複雑さを理解することができました。現在、サンガーシーケンスを使用して、NGSを使用して同定したバリアントを検証しています。

NGSでは、1人の被験者のサンプルを200の遺伝子について解析するのに約2日かかります。サンガーシーケンスを使用した場合、同じ解析を完了するのにおそらく数か月かかるでしょう。

Q：全ゲノム研究やエクソーム研究ではなく、ターゲットマルチ遺伝子パネル検査を実施することにした理由は何ですか？

FT：最初のアプローチとして、全ゲノムシーケンス（WGS）研究は費用がかかり、バイオインフォマティクスが複雑です。当社の優先事項は、関心のある遺伝子をほぼ100%カバーするパネルを持つことであるため、全エクソームシーケンス（WES）の追加費用は必要ありません。失調症や痙性対麻痺、神経障害、白質ジストロフィー（中心性ミエリン障害）、筋萎縮性側索硬化症、てんかんなど、さまざまな疾患に対して5つのターゲットシーケンスパネルを作成することを選択しました。ターゲットマルチ遺伝子パネル検査は安価であるだけでなく、偶発的な所見の複雑な問題も排除します。

Q：神経疾患や代謝疾患に関連するバリアントを同定するために使用するNGSベースのターゲットシーケンスワークフローは何ですか？

FT：当社のNGSワークフローはMiSeqシステムに基づいており、1回のランで12～24の被験者サンプルを処理できます。まず、安価で小型のプレスクリーニングパネルから始め、必要に応じて大型のターゲットマルチ遺伝子パネルに移行します。ターゲットとする遺伝子の数に応じて、Nextera® XT DNAまたはNextera Rapid Capture Custom Enrichment Library Prep Kitsを使用して、マルチ遺伝子パネル用のサンプルを調製します。

まず、被験者が呈する疾患に対して最も一般的に変異しているいくつかの遺伝子を用いてサンプルをスクリーニングします。このターゲットスクリーニングで病原性バリアントの25～35%をキャプチャします。遺伝子セットは、解析したい疾患や表現型によって異なります。例えば、運動失調症の被験者は通常、4～6個の一般的に見られる遺伝子を持っており、これらは最初にスクリーニングする遺伝子です。これらの狭いターゲットマルチ遺伝子パネルでは、Nextera XT DNA Library Prep Kitを使用して対象サンプルを調製し、アンプリコンライブラリーを作成します。

これらの遺伝子が陰性の場合、より広いネットをキャストし、マルチ遺伝子パネルを用いてターゲットシーケンスの第2ラウンドを実施します。各パネルは、特定の疾患に関連するほぼすべての遺伝子で構成されています（パネルあたり70～200個の遺伝子）。例えば、運動失調症のパネルには、運動失調を主な症状として引き起こすことが知られているすべての遺伝子が含まれます。白質ジストロフィーパネルには、中枢神経系で脱髄を引き起こすすべての遺伝子などが含まれています。これらの広範なターゲットマルチ遺伝子パネルには、Nextera Rapid Capture Custom Enrichment Kitを使用します。このキットは、特に被験者が多数の遺伝子を含む表現型の連続性を有する場合に有用です。例えば、運動失調症の人は、痙性対麻痺の特徴も有している可能性があり、その逆も同じです。さまざまな疾患遺伝子を検査するために、2つの別々のパネルではなく、1つのパネルを持つことは利点です。Nextera Rapid Capture Custom Enrichmentでは、コピー数の変動も解析できるため、疾患を引き起こす可能性のある欠失や重複をピンポイントで特定できます。

疾患パネルを使用して疾患バリアントの存在を同定しない場合、エクソームシーケンスを使用して、関心のあるバリアントを同定するためにさらに広いネットをキャストします。

ターゲットとする遺伝子の数に応じて、Nextera XT DNAまたはNextera Rapid Capture Custom Enrichment Library Prep Kitsを使用して、マルチ遺伝子パネル用のサンプルを調製します。

Q：パネルに新しい遺伝子をどのように組み入れますか？

FT：当社のパネルは定期的に再設計されています。再注文するたびに、私たちや他の人が研究で特定した可能性のある新しい遺伝子を追加する機会があります。Nextera Rapid Capture Custom Enrichment Kitは多くの遺伝子に対応していますが、新しい遺伝子のスペースを作るためにいくつかの遺伝子を取り出す必要が生じることがあります。

Q：ターゲットリシーケンス研究を実施するためにMiSeqシステムを選んだ理由は何ですか？

FT：MiSeqシステムは、データ品質、特にリピート塩基の長い伸長によるシーケンスの観点から、予算と信頼性に基づいて選択されました。システムの速度と汎用性も、私たちの決定の要因となりました。

Q：データをどのように解析しますか？

FT：データ解析はVariantStudio Software^*から始まります。データはその後、CLC Genomics WorkbenchやDatabaseなどの一般公開されている商用ソフトウェアを含むパイプラインに入ります。データベースを使用してバリアントをフィルタリングし、EVS、HGMB、ExAC、1000ゲノムなどのその他のツールもフィルタリングします。

イタリアの集団で見られるバリアントを研究するために、独自のローカルデータベースを構築しました。ほとんどの公開されているデータベースは、北米またはアングロサクソンの遺伝子型に基づいています。当社のデータベースは、バイオインフォマティクス解析に重要な多型分布のイタリアのばらつきに効果的に対応しています。

また、アミノ酸置換のSorting Intolerant from Tolerant（SIFT）やPolymorphism Phenotyping（PolyPhen）、RNAスプライシングのNNSpliceやAlternative Splice Site Predictor（ASSP）など、予測される機能効果についてバイオインフォマティクスツールを用いてバリアントを解析します。インシリコ予測の検証には、タンパク質およびRNAレベルのin vitro機能評価がしばしば必要です。ウェットラボ法を用いてバリアントの検証を試みますが、これは必ずしも可能とは限りません。私たちが評価している特定の遺伝子に対する機能アッセイが存在しないことがよくあります。

Q：MiSeqシステムにおけるNGSベースのパネルの出力とターンアラウンドタイムは、Sangerシーケンスを使用したバリアントの同定と比較してどうですか？

FT：NGSは、解析された遺伝子数と、レポートと解析の出力の複雑さという点で、サンガーシーケンスよりも優れています。サンガー時代には、一度に1つの遺伝子のみをシーケンスすることができ、その特定の遺伝子の特定のシーケンスセクションに関するレポートを作成しました。ターンアラウンドタイムは非常に長く、限られた数の遺伝子しかシーケンスできませんでした。

NGSでは、200の遺伝子について1人の被験者のサンプルを解析するのに約2日かかります。サンガーシーケンスを使用した場合、同じ解析を完了するのにおそらく数か月かかるでしょう。

標的シーケンスプロセスを用いてMiSeqシステムを用いて、新しい遺伝子と表現型を迅速に同定しました。

Q：このプロセスでどのような遺伝子を発見しましたか？

FT：MiSeqシステムを用いたターゲットシーケンスプロセスを使用して、新しい遺伝子と表現型を迅速に同定しました。パネルはできるだけ包括的に設計されており、特定の関心表現型を引き起こすまれな遺伝子も含まれていることを意味します。通常、対象サンプルにおける変異の提示方法とは異なる表現型に起因する遺伝子の変異など、予期しない結果に遭遇することがあります。このような場合、すでに知られている遺伝子に新しい表現型が発見されました。

2例では、エクソームシーケンスによる新規遺伝子を同定しました。最初のスクリーニングとパネルシーケンスで陰性であったミエリン障害の被験者からのサンプルでした。変異は比較的まれです。2つの遺伝子の研究は完了しており、研究はまだ発表されていません。表現型に関連する新しい遺伝子を見つけることは、常に興味深いことです。

また、白質ジストロフィーと末梢神経障害パネルで多くの変異を特定した興味深い症例の結果を報告する2つの論文にも取り組んでいます。希少疾患を持つ被験者にとって、この疾患の原因を知らないことは非常に苛立っています。したがって、当社の潜在的な解析率を高めることは非常に重要です。

Q：あなたのラボはサンガーからNGSへの移行をどのように認識しましたか？

FT：サンガーからNGSへの劇的な変更でした。NGSはより複雑で、すべての人がこの新しいテクノロジーを完全な自律的な方法で使用しているわけではありません。Nextera Rapid Captureライブラリーを調製したり、結果を解析したりしたチームメンバーは比較的少数ですが、多くの人がNextera XTライブラリーを作成し、シーケンスランを実施しています。私たちのラボの文化と、このシステムの可能性に対する人々の見方を変えました。

Q：研究の次のステップは何ですか？

FT：臨床医と協力して、患者、家族、その他の親族からサンプルを取得し、結果のデータベースを作成したいと考えています。これは、私たちの研究に大きな違いをもたらします。これにより、イタリアの集団における正常変異および病理学的変異の詳細なデータベースを持てるようになり、シーケンスプロジェクトにおけるフィルタリング能力が向上します。患者と直接取引しないため、自分でできるものではありません。

Beyond the Exomeと呼ばれるヨーロッパのプロジェクトに入社したばかりです。プロジェクトの範囲は、すでにエクソームシーケンスを受けた未解決の症例に、さまざまな研究アプローチ（RNAシーケンス/トランスクリプトミクス、プロテオミクス、WGS）を統合することです。シーケンス研究を単一細胞に拡張し、機能解析を実施します。NextSeq®500システムでRNA-Seqを実施することを楽しみにしています。