アンプリコンシーケンスがPEHバリアントを解明
研究者は、表現型によって異なる運動強度依存性PEH関連バリアントを発見しました。
アンプリコンシーケンスにより、運動後低血圧（PEH）のバリアントが明らかになります
はじめに
運動中に血圧が上昇することが知られています。科学者や研究者は、運動が終わった後の血圧の変化も観察しています。一部の人では、運動しない日よりも急性期または短期の運動を行う日の方が血圧が低くなります。これは運動後低血圧（PEH）として知られる現象です。1 時として、これらの血圧低下は、1日の残りの期間を通して、高血圧を正常血圧域にできるほど大きくなることがあります。Linda S. Pescatello博士は、コネチカット大学の運動学の著名な教授で、PEHがなぜある人で起こるのか、他の人では起こらないのかを解明するために研究を始めました。
Pescatello博士とそのチームは、2001年に運動ゲノミクスの研究を開始しました。腎臓系は主要な血圧調節因子であるため、1回の運動に対する被験者の異なる血圧反応に関連する腎バリアントの同定に焦点を合わせました。研究者らは、変異を同定するために候補遺伝子関連研究を実施し、各多型がPEHをどのように追跡したかを記録しました。この初期の研究から、彼女のチームは、ACE 、AGT 、AGTR1 、CYP11B2 、ADD1 など、関心のあるいくつかの腎遺伝子を特定しました。 AGTR1
Pescatello博士は2011年に、コネチカット州のゲノム研究センターであるJackson Laboratory Scientific Services, Genome Technologies Groupとの提携を開始しました。次世代シーケンサー（NGS）を用いて、被験者サンプルのディープアンプリコンシーケンスを実施し、その結果が降圧ライフスタイル療法として運動に反応する人や反応しない人に役立つかどうかを調べました。2このアプローチでは、アフリカ系アメリカ人では運動強度依存的なPEHの関連性が示されたが、白人では示されなかったバリアントを特定しました。
iCommunityはPescatello博士と、アンプリコンシーケンスが運動に対する心腎反応の根底にある遺伝的変異に関する詳細な情報を提供した方法について話しました。
Linda S. Pescatello博士は、コネチカット大学の運動学の研究者で著名な教授です。
Q：運動ゲノミクスの分野に興味を抱いたきっかけは何ですか？
Linda S. Pescatello（LSP）：生物学とスポーツには常に情熱を持っており、私の人生は2つの幸福な融合を反映しています。子供の頃、父はマイナーリーグの野球をし、母は看護師でした。コネチカット大学では、生化学の専攻でソフトボール、バスケットボール、テニスをしていました。
大学院に入学したとき、運動科学の分野は新しいものでした。科学とスポーツへの愛の完璧な融合であることに気づきました。私が行う運動研究は、人々の健康や生活の質にプラスの影響を与える可能性があります。それが私のモチベーションになります。
Q：候補遺伝子の関連研究を開始したのはいつですか？
LSP：1998年、運動に対する健康関連表現型の反応に対する遺伝学の影響に対する関心が高まっています。2000年代初頭には 私は、アポリポタンパク質（APO）E多型がトレーニング応答に与える影響を調べる研究の共同研究者でした。3 また、ヒトの筋肉のサイズと強度に関連する一塩基多型（FAMuSS）の多施設共同研究にも関与しました。4 また、 私は、米国心臓協会のPEHに対する運動強度の影響に関する研究の治験責任医師でした。5、6 いずれも運動に対する健康関連表現型の反応に関与する可能性のある個々のバリアントを調べた候補遺伝子関連研究でした。 心肺フィットネスや 筋肉の大きさと強度 そして血圧です
"...バリアントの同定において、ヒットとミスの遺伝子関連研究がどのように行われているかが明らかになりました。漁業の遠征のようなものでした。"
Q：当初、PEHに関与すると考えられるバリアントは何種類ありましたか？
LSP：PEH候補遺伝子の関連研究を初めて開始したとき、多くの人が、健康関連表現型の運動反応の大部分を説明する数種類の一塩基多型（SNP）を見つけるつもりだと思いました。それはそうではないことが判明しました。
Q：PEH研究ではどのような運動研究デザインを用いましたか？
LSP：被験者は1日に急激に運動し、別の日に安静にし、その日数を被験者間で無作為化しました。毎日、被験者は携帯型血圧モニターを持って帰宅し、仕事や家族生活などの日々のプレッシャーに直面しました。被験者が運動した日は、運動しなかった日よりも血圧が有意に低いことがわかりました。
遺伝子関連研究を用いて、運動に対する血圧反応の違いの原因となりうる遺伝子変異に違いがあるかどうかを調べました。PEHといくつかの腎バリアントとの関連が明らかになりました。
Q：遺伝子関連研究を実施するためにどのようなテクノロジーを使用しましたか？
LSP：qPCRアリル識別アッセイを用いてジェノタイピングを実施しました。各SNPについて、アリル特異的PCRを実施しました。このアプローチを用いて、バリアントのごく一部を説明する多くの多型を特定しました。しかし、変異の同定において、ヒットアンドミス遺伝子関連研究がどのように行われたかは明らかになりました。漁業の遠征のようなものでした。NGSにより、ゲノムのはるかに大きな部分を同時に見ることができることに気づきました。
Q：研究にNGSを使い始めたのはいつですか？
LSP：2011年に、当研究所がジャクソン研究所との共同研究を開始した際にNGSの使用を開始しました。7文献の系統的レビューを行い、41の遺伝子を考案しました。これらには、過去の遺伝子関連研究で同定された腎バリアントや、運動、高血圧、肥満に対する血圧反応に関連する他の人々が同定したバリアントが含まれていました。
これら41遺伝子のターゲットシーケンスパネルをデザインしました。アンプリコンシーケンスは、過去の遺伝子関連研究で用いたものと同じ運動プロトコールを受けた肥満成人（アフリカ系アメリカ人14名、白人9名）から採取した23サンプルを用いて、Jackson Laboratoryで実施されました。アフリカ系アメリカ人は高血圧の発生率が不均衡である傾向があり、予後はしばしば悪化します。
"ターゲットアプローチを用いることで、ゲノムの検索スペースを減らし、フィールドを前進させるための重要な情報を見つけることができました。"
Q：全エクソームシーケンスではなく、アンプリコンシーケンスを選択した理由は何ですか？
LSP：ターゲットアンプリコンシーケンスアプローチを選んだのは、これを別の漁業探検にしたくなかったからです。コストの問題もありました。エクソームシーケンスは、このプロジェクトを経済的に禁じていたでしょう。ターゲットアプローチを用いることで、ゲノムの検索スペースを減らし、フィールドを前進させるための重要な情報を見つけることができました。
Q：NGS PEH試験の結果はどうでしたか？
LSP：NGS PEH研究は驚異的なヒット率を示しました。パネル内の遺伝子の25%はPEHと関連していました。これらの遺伝子の75%では、白人とアフリカ系アメリカ人の関連性が異なっていました。当初存在していたと考えられていたよりも多くの関連性を発見しました。
アフリカ系アメリカ人のグループではPEHと相関するが、白人では相関しない、ACE 、AGTR11 、CYP11B2 、ADD1のバリアントを特定しました。観察した関連性は、激しい運動または高強度の運動に関するものでした。マイナーアリルの数が増加すると、一般的にはアリルを担持するリスクとなり、運動後の血圧は対照群と比較して20～30 mmHg低下しました。また、中等度の運動後にアフリカ系アメリカ人の被験者の血圧が実際に上昇した2つの腎バリアントも特定しました。
Q：どのようにデータを解析しましたか？
LSP：Jackson Laboratoryは、データを解析するためのバリアントコーリングファイルを当社に提供してくれました。本研究は、わずか23例の被験者を対象とした予備的な研究であったため、方法論的戦略を用いて研究の統計的検出力を高め、関連性を検出しました。コネチカット大学の統計学者であるElizabeth D. Schifano博士と協働しました。具体的には、被験者が携帯型血圧モニターを装着した19時間にわたるPEHの関連性を調べました。我々は、時間、付加モデルにおける多型、および複数の検査用に調整された多型相互作用を含む線形モデルを用いて、バリアントコーリングから出現した多型関連を解析しました。
Q：これらの結果は、特定の被験者の高血圧と闘うための運動の使用にどのように役立つでしょうか？
LSP：特定の遺伝子型では、これらの結果は、激しい強度の運動が運動の降圧効果を最大化する可能性があることを示唆しています。個別化医療の約束はまだ数年先ですが、この研究は、PEH被験者の運動処方を微調整するための予測方程式の開発に一歩近づきました。
"すでにマルチレベルのオミクスパスを開始し、サンプルの一部でRNA発現を調べています。"
Q：研究の次のステップは何ですか？
LSP：PEH研究では、その他の腎臓以外の遺伝子バリアントが重要視され、これらのデータを解析しています。この予備研究から得られたデータは、大規模なプロジェクトのベースラインとしても役立っています。現在、約300名の被験者、アフリカ系アメリカ人半数、白人半数を対象に、同じ手法と200を超える遺伝子の優先パネルを使用して、運動研究の計画と資金調達を進めています。
Q：将来の研究において、マルチレベルオミクスアプローチの利点は何ですか？
LSP：PEHのゲノム統合をDNA、mRNA、タンパク質などのさまざまなレベルで研究し、運動に対する血圧反応の大きな変動要因となる制御経路を決定することは有益です。メチル化とエピジェネティクスの研究も含まれると思います。マルチレベルのオミクスパスをすでに開始しており、一部のサンプルでRNA発現を調べています。
Q：研究のためにアンプリコンシーケンスを検討している研究者にどのようなアドバイスをしますか？
LSP：ターゲットエクソンパネルの作成方法やアンプリコンシーケンスの実施方法に精通している人と話すことをお勧めします。この運動研究にアンプリコンシーケンスを使用することは、科学の複雑さを考慮すると容易でした。
また、研究者が最終的な目標を念頭に置くことも重要だと思います。資金を得ることはますます難しくなっていることを、誰もが知っています。その理由の1つは、大規模な研究とビッグデータに重点を置いているためです。私たちは、この分野に多大な貢献をすることができる、優れた研究者主導の研究の必要性を見失うべきではありません。
この研究で使用されるイルミナのシステムと製品の詳細はこちら：
MiSeqシステム、www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/miseq.html
参考文献
- マクドナルドJR. 運動後の低血圧の潜在的な原因、メカニズム、および影響。Jハム高血圧症。2002;16:225–236。
- Pescatello LS, Schifano ED, Ash GI, et al. ディープターゲットエクソンシーケンスにより、アフリカ系アメリカ人の運動後低血圧に関連する腎多型が明らかになります。Physiol Rep . 2016;4(19). pii: e12992。Epub 2016年10月10日。
- Seip RL, Otvos J, Bilbie C, et al. 運動に対する血清リポタンパク質粒子応答に対するアポプリポタンパク質E遺伝子型の影響。アテローム性動脈硬化症。2006;88:126–133。
- Thompson PD, Moyna N, Seip R, et al. ヒトの筋肉の大きさと強度に関連する機能的多型。Med Sci Sports Exerc .2004;36:1132–1139。
- Pescatello LS, Blanchard BE, Tsongalis GJ, et al. 高血圧男性におけるα-アデューシンGly460Trp多型と運動の降圧効果。Clin Sci（Lond） 2007;113:251–258。
- Blanchard BE, Tsongalis GJ, Guidry MA, et al. RAAS多型は、高血圧男性の有酸素運動に対する急性血圧反応を変化させます。Eur J Appl Physiol . 2006; 97:26–33。
- ジャクソン研究所。ゲノムテクノロジー、JAX教職員のための科学研究サービス。www.jax.org/research-and-faculty/tools/scientific-research-services/genome-tech-single-cell-biology/genome-technologies#. 2017年4月28日にアクセス。